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吖啶橙(Acridine Orange，AO)屬于三環(huán)雜芳香燃料，可以標記DNA、RNA，屬于異染性熒光染料。該染料具有膜通透性，能透過細胞膜，使核DNA和RNA染色。因此AO常用于細胞內(nèi)DNA和RNA進行檢測。AO與核酸結(jié)合方式主要有：1、插入性結(jié)合，AO嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，這種結(jié)合方式主要為AO與DNA的結(jié)合，其熒光發(fā)射峰為530nm，激發(fā)后呈綠色熒光；2、靜電吸引，帶正電荷的AO與單鏈核酸的磷酸根(帶負電荷)產(chǎn)生靜電間的吸引結(jié)合，這種結(jié)合方式主要為AO與RNA的結(jié)合，其熒光發(fā)射峰為640nm，激發(fā)后呈紅色熒光，少量結(jié)合會呈桔黃色或桔紅色熒光。因此，吖啶橙嵌合到雙鏈DNA分子中顯綠色，與DNA單鏈或RNA結(jié)合時發(fā)桔黃色或橙紅色熒光。 

吖啶橙染色試劑盒(Acridine Orange Detection Kit)主要由AO Stain、AO Stain Buffer組成，常用于細胞凋亡的檢測。染色后在熒光顯微鏡下觀察，吖啶橙可透過正常細胞膜，使細胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光；而在凋亡細胞中，因染色質(zhì)固縮或斷裂為大小不等的片斷，形成凋亡小體。吖啶橙使其染上致密濃染的黃綠色熒光或黃綠色碎片顆粒；而壞死細胞黃熒光減弱甚至消失。吖啶橙染色常與EB染色合用雙染，EB只染死細胞使之產(chǎn)生桔黃色熒光，由此可區(qū)分出正常細胞、凋亡細胞及壞死細胞。

1、 熒光顯微鏡 

2、 低速離心機 

3、 PBS

4、 細胞計數(shù)板 

5、 載玻片、蓋玻片 

操作步驟(僅供參考)：

(一) AO單獨染色

1、 收集細胞(采用流式細胞儀檢測時，應(yīng)先固定細胞)，用AO Stain Buffer(1×)清洗細胞1次，加入適量的AO Stain Buffer(1×)重懸細胞，計數(shù)并調(diào)節(jié)細胞濃度至106/ml。 

2、 取適量的細胞懸液和AO Stain，按照細胞懸液：AO Stain=19：1的比例混合，輕輕混勻。如果采用熒光顯微鏡下觀察，一般取95μl細胞懸液和5μl AO Stain混合即可。 

3、 室溫避光染色15min，滴加于載玻片上并加蓋玻片或上流式細胞儀分析。 

4、 熒光顯微鏡下觀察(激發(fā)濾光片波長488nm，阻斷濾光片波長515nm)，計數(shù)并拍照。 

染色結(jié)果：

正常細胞 

細胞被均勻染成黃綠色熒光 

凋亡細胞 

染色質(zhì)濃縮，細胞核碎裂成點狀，被染成大小不一、致密濃染的綠色顆粒 

(二) AO/EB雙染色 

1、 收集細胞，用AO Stain Buffer(1×)清洗細胞1次，加入適量的AO Stain Buffer(1×)重懸細胞，計數(shù)并調(diào)節(jié)細胞濃度至106/ml。 

2、 取適量的細胞懸液和AO Stain，按照細胞懸液：AO Stain=19：1的比例混合，并加入適量EB染色液，輕輕混勻。如果采用熒光顯微鏡下觀察，一般取95μl細胞懸液和5μl AO Stain混合即可。 

3、 室溫避光染色15min，滴加于載玻片上并加蓋玻片 

4、 熒光顯微鏡濾光片515nm觀察，計數(shù)并拍照。 

染色結(jié)果：

正常細胞 

均勻染成綠色熒光 

壞死細胞 

細胞桔黃色熒光 

凋亡細胞 

染色質(zhì)濃縮，細胞核碎裂，被染成大小不一、致密濃染的黃綠色顆?；蛞姲|(zhì)芽狀突起。 

計算細胞凋亡率和死亡率:

細胞死亡率=凋亡細胞/細胞總數(shù)×100%   細胞壞死率=壞死細胞/細胞總數(shù)×100%

注意事項：

1． 吖啶橙染色常不EB染色合用，可區(qū)分出正常細胞、凋亡細胞及壞死細胞。 

2． 如有低溫離心機進行離心效果更佳，同時應(yīng)注意減少試劑暴露于強光下的時間。 

3． 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。