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細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒(Hoechst Staining Kit)是一種采用經(jīng)典的Hoechst33258進行細胞凋 亡檢測的快速簡便的試劑盒。當細胞發(fā)生凋亡時，染色質會固縮，Hoechst33258 染色后在熒光顯微 鏡下觀察，正常細胞的細胞核呈正常的藍色，而凋亡細胞的細胞核會呈致密濃染，或呈碎塊狀致密 濃染，顏色有些發(fā)白。Hoechst Staining Kit 經(jīng)常用于培養(yǎng)的貼壁或懸浮細胞以及組織切片的細胞凋 亡檢測。該試劑盒檢測細胞含量范圍一般為 0.1～1×106之間。 
1、 可觀察藍光的熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡

2、 PBS或生理鹽水

3、 載玻片、蓋玻片

4、 預冷固定液：預冷的70%乙醇或4%多聚甲醛 
(僅供參考)：

(一)貼壁細胞

1、取潔凈蓋玻片在70%乙醇中浸泡5min或更長時間，無菌超凈臺內(nèi)吹干或用無菌的PBS或生理鹽水 洗滌3次，再用細胞培養(yǎng)液洗滌1次。將蓋玻片置于6孔板或其他培養(yǎng)皿內(nèi)，接種細胞培養(yǎng)過夜， 使融合率約為50%～80%。

2、加入干預條件使細胞發(fā)生凋亡后，吸盡培養(yǎng)液，加入Hoechst固定液0.5ml，固定10min或更長時 間(可4℃過夜)。

3、去除固定液，用PBS或生理鹽水洗2次，每次3min，吸盡液體。洗滌時宜用搖床，或手動晃動。

4、加入Hoechst 33258染色液0.5ml，孵育5min。也宜用搖床，或手動晃動數(shù)次。

5、棄染色液，用PBS或生理鹽水洗2次，每次3min，吸盡液體。洗滌時宜用搖床，或手動晃動。

6、滴一滴抗熒封片劑于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，讓細胞接觸封片劑，盡量避免氣泡。

7、熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。激發(fā)波長350nm左右，發(fā)射波長460nm左右。

(二)懸浮細胞

1、離心收集細胞樣品于1.5ml離心管內(nèi)并棄液，加入Hoechst固定液0.5ml，緩緩懸起細胞，固定10min 或更長時間(亦可4℃過夜)。

2、低速離心去除固定液，用PBS或生理鹽水洗2次，每次3min。洗滌時手動晃動數(shù)次

3、低速離心離心后吸去大部分液體保留約50μl液體，再緩緩懸起細胞，滴加至載玻片上，盡量使細 胞分布均勻。

4、稍晾干，使細胞貼在載玻片上不易隨液體流動。

5、滴加Hoechst 33258染色液0.5ml，孵育5min。用吸水紙從邊緣吸去液體，微晾干。

6、棄染色液，用PBS或生理鹽水洗2次，每次3min，吸盡液體。洗滌時宜用搖床，或手動晃動。

7、滴一滴抗熒光封片劑于載玻片上，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。

8、熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。激發(fā)波長350nm左右，發(fā)射波長460nm左右。

(三)組織切片

1、常規(guī)包埋切片。

2、用PBS或生理鹽水洗2次，每次3min。洗滌時手動晃動數(shù)次。

3、均勻滴上Hoechst 33258染色液0.5ml，孵育5分鐘。

4、棄染色液，用PBS或生理鹽水洗2次，每次3min，吸盡液體。洗滌時宜用搖床，或手動晃動。

5、 將切片置于載玻片上，滴一滴抗熒光封片劑，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。

6、熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。激發(fā)波長350nm左右，發(fā)射波長460nm左右。

1、 熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測。使用抗熒封片劑時也應避光操作。

2、 在為了獲得細胞沉淀的離心的過程中，對于特殊細胞，如果細胞沉淀不充分，可以適當提高離 心力或延長離心時間。

3、 Hoechst 33258染色液對人體有一定刺激性，請注意適當防護。  4、 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。