4007787550
作者：牛志云，潘崚，劉英杰，張學(xué)軍，索曉慧
【摘要】 本研究觀察不同濃度藻藍(lán)蛋白（phycocyanin）對K562細(xì)胞增殖的影響，并檢測藻藍(lán)蛋白處理后細(xì)胞表面整合蛋白β1表達(dá)和胞內(nèi)黏著斑激酶（FAK）基因表達(dá)的變化，探討整合蛋白β1在藻藍(lán)蛋白抑制K562細(xì)胞增殖中的可能作用機(jī)制。用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測藻藍(lán)蛋白處理前后K562細(xì)胞表面整合蛋白β1表達(dá)變化；MTT法測定不同濃度藻藍(lán)蛋白對K562細(xì)胞增殖的影響；RT-PCR檢測不同濃度藻藍(lán)蛋白對K562細(xì)胞內(nèi)FAK基因表達(dá)的作用。結(jié)果表明：整合蛋白β1在K562細(xì)胞上高表達(dá)；藻藍(lán)蛋白不能改變其表達(dá)量。不同濃度藻藍(lán)蛋白對K562細(xì)胞的增殖均有抑制作用。藻藍(lán)蛋白可上調(diào)胞內(nèi)FAK的基因表達(dá)水平，恢復(fù)整合蛋白β1介導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制信號。結(jié)論：藻藍(lán)蛋白可能通過增強(qiáng)細(xì)胞基質(zhì)與K562細(xì)胞表面的整合蛋白β1結(jié)合，上調(diào)K562細(xì)胞內(nèi)FAK基因表達(dá)水平，恢復(fù)整合蛋白β1介導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制信號而發(fā)揮抑制K562細(xì)胞增殖的作用。
【關(guān)鍵詞】 藻藍(lán)蛋白；整合蛋白；白血??； K562細(xì)胞； 細(xì)胞增殖
Effects of Integrin β1 on Phycocyanin Inhibiting Proliferation of K562 Cells
Abstract This study was purposed to investigate the effect of phycocyamin at different concentration on proliferation of K562 cells，to detect the changes of integrin β1 expression and intracellular focal adhesion kinase (FAK) gene expression on the surface K562 cells treated with phycocyanin，and to explore the possible machanism of integrin β1 effect on phycocyanin inhibiting proliferation of K562 cells. The expression level of integrin β1 on the surface of K562 cells was evaluated by flow cytometry (FCM); the growth of K562 cells treated with phycocyanin was measured by MTT assay; the expression level of FAK mRNA was analyzed by relatively quantitative RT-PCR after four-day culture of K562 cells with phycocyanin of 40 μg/ml，80 μg/ml and 160 μg/ml，respectively. The results showed that integrin β1 expression on the surface of K562 cells was significantly higher than that in bone marrow mononuclear cells (BMMNC) from normal subjects. Phycocyanin could not change the level of integin β1 expression. Phycocyanin could increase the expression of FAK gene on K562 cells and inhibit the proliferation of K562 cells. It is concluded that phycocyanin can inhibit the proliferation of K562 cells through enhancing the conjunction of cell stroma with integrin β1 on K562 cell surface，up-regulating the expression level of FAK gene in K562 cells，restoring the signaling pathway of proliferation inhibition mediated by integrin β1. The possible mechanism of phycocyanin in the proliferation inhibition of K562 cells is to increase the expression of FAK gene. The phcocyanin may be considered as a potential agent for inhibition of cancer cell proliferation.
Key words phycocyanin; integrin; leukemia; K562 cell; cell proliferation
藻藍(lán)蛋白（phycocyanin）是螺旋藻中的一種有效成分，可提高機(jī)體的免疫力，抵抗疾病的發(fā)生［1］。研究發(fā)現(xiàn)，藻藍(lán)蛋白對體外培養(yǎng)的HeLa、HL-60、K562以及U-937等細(xì)胞的生長有較強(qiáng)抑制作用［2］，但其抑制細(xì)胞生長的作用機(jī)制尚不清楚。
慢性粒細(xì)胞白血?。?/font>CML）患者體內(nèi)存在的CML ph+細(xì)胞可異常增殖并逃避凋亡。研究證實(shí)，CML ph+細(xì)胞的這些特點(diǎn)與整合蛋白β1介導(dǎo)的黏附及增殖抑制功能存在障礙密切相關(guān)［3］。近年來研究表明，整合蛋白β1活化抗體8A2可明顯改善CML ph+細(xì)胞的黏附功能；干擾素可通過降低ph+細(xì)胞內(nèi)整合蛋白信號通路中的黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）的過度磷酸化，增加正常功能狀態(tài)的FAK含量，增強(qiáng)整合蛋白介導(dǎo)的增殖抑制作用［4，5］。本研究以慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞為研究對象，通過檢測藻藍(lán)蛋白對K562細(xì)胞的增殖影響，并觀察整合蛋白β1在此過程中所發(fā)揮的作用及FAK基因表達(dá)的改變，探討藻藍(lán)蛋白是否通過恢復(fù)整合蛋白β1的功能而發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的。
材料和方法
細(xì)胞系與試劑
CML急變期細(xì)胞系K652細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物教研室惠贈，正常人的骨髓單個核細(xì)胞（BMMNC）和CML急變期病人BMMNC采自臨床標(biāo)本。鼠抗人整合蛋白β1單克隆抗體和羊抗鼠熒光抗體FITC購自蘇州Coulter公司。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)液和四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購于華美公司。藻藍(lán)蛋白由衡水博生生物公司惠贈，用前以無菌三蒸餾水稀釋成所需濃度。小鼠IgG同型對照抗體購自鼎國生物公司。TRIZOL RNA提取液、隨機(jī)引物、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶及TaqDNA聚合酶、dNTP等PCR反應(yīng)體系均購自華美生物工程公司。FAK引物由Primer 5.0軟件設(shè)計，北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。
懸浮培養(yǎng)模型的建立
K562細(xì)胞置于含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37℃、5％ CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以5×106／ml細(xì)胞接種于24孔板。藻藍(lán)蛋白終濃度分別為40 μg/ml、80 μg/ml和160 μg/ml。
K562細(xì)胞整合蛋白β1表達(dá)水平的流式細(xì)胞術(shù)測定
收集對數(shù)生長期細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為5×106／ml，取細(xì)胞懸液100 μl，一組加10 μl抗整合蛋白β1（CD29）單克隆抗體，另一組加小鼠IgG為同型對照，輕微混勻，4℃避光放置30分鐘；離心去上清，用冷PBS洗滌2遍，去除多余抗體；分別加入羊抗鼠FITC二抗10 μl 及冷PBS 100 μl，吸打混勻，4℃避光放置30分鐘；用冷PBS洗滌后將細(xì)胞重懸于200 μl冷PBS中，混勻并移至流式專用管內(nèi)，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測整合蛋白β1表達(dá)陽性的細(xì)胞率，應(yīng)用CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。
不同濃度藻藍(lán)蛋白對K562細(xì)胞增殖影響的MTT比色法測定
取對數(shù)生長期的濃度為5×106／ml的K562細(xì)胞懸液，按每孔1 ml接種到24孔平底培養(yǎng)板中，設(shè)3個藻藍(lán)蛋白濃度實(shí)驗組（40 μg/ml組、80 μg/ml組、160 μg/ml組），每組各設(shè)6個平行孔，連續(xù)培養(yǎng)1-6天后進(jìn)行檢測。從24孔板中每孔移取50 ml細(xì)胞液于96孔板的相應(yīng)孔中，另外設(shè)陰性對照組。于培養(yǎng)結(jié)束前4小時在96孔板中每孔加入1 0 μl MTT溶液（5 mg/ml），離心棄上清，加入200 μl DMSO，充分溶解結(jié)晶物，然后用酶標(biāo)儀測490 nm處吸光度A值，繪制細(xì)胞生長曲線。細(xì)胞增殖抑制率＝（1－處理組A值／對照組A值）×100％。
RNA提取和濃度測定
分別離心收集各組K562細(xì)胞，用TRIZOL抽提總RNA。用2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取的RNA的完整性并觀察其降解情況，在紫外分光光度儀上測定RNA樣品A260 和A280比值。再用DEPC水將各組總RNA調(diào)整至同一濃度。
各組K562細(xì)胞內(nèi)FAK mRNA表達(dá)水平的RT-PCR檢測
20 μl逆轉(zhuǎn)錄體系中含50 μg/ml隨機(jī)引物1 μl，5×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4 μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，50 U/μl RNasin 0.5 μl，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶15 U，余用DEPC水補(bǔ)足20 μl。于37℃、60分鐘逆轉(zhuǎn)錄2 μg總RNA中的mRNA為cDNA，95℃ 反應(yīng)5分鐘后終止反應(yīng)。使用50 μl反應(yīng)體系同時擴(kuò)增目的基因和GAPDH基因，具體循環(huán)參數(shù)如下： 94℃預(yù)變性2分鐘進(jìn)入循環(huán)，94℃變性40秒，54℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，經(jīng)40個循環(huán)擴(kuò)增后72℃延伸10分鐘。GAPDH基因上游引物：5’-CGGGAAGCTTGTGATCTT TGG-3’； 下游引物：5’-GGCATGGATGGCATGGACTGA-3’；引物擴(kuò)增片段長度為358 bp。FAK上游引物：5’-TTGCGGAGAATATGGCTGACCTAA-3’； 下游引物：5’-TGGTATTGATGGCAAAGCCCGTTC-3’； 引物擴(kuò)增片段長度為116 bp。取10 μl RT-PCR產(chǎn)物及10 μl DNA marker進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，采用MULIT IMAGE凝膠圖像分析儀進(jìn)行吸光度掃描，觀察條帶的灰度強(qiáng)弱，結(jié)果以目的基因與GAPDH的積分吸光度的比值表示。
統(tǒng)計學(xué)處理
數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ X±SD）表示，利用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。多組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）中LSD檢驗，P＜0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果
K562細(xì)胞高表達(dá)整合蛋白β1
經(jīng)FCM測定，正常人BMMNC和K562細(xì)胞整合蛋白β1(CD29)陽性表達(dá)率分別為72.40±3.56%和99.24±0.52%，后者較前者明顯增高（P<0.05）。CML急變期病人BMMNC整合蛋白β1陽性表達(dá)率為93.43±1.67%，較正常人組顯著增加（P<0 05）。這些結(jié)果表明，K562細(xì)胞和CML病人BMMNC整合蛋白β1表達(dá)升高。藻藍(lán)蛋白處理后K562細(xì)胞整合蛋白β1陽性表達(dá)率與未處理組比較無明顯改變（圖1）。
藻藍(lán)蛋白抑制K562細(xì)胞增殖
MTT檢測結(jié)果顯示，各濃度藻藍(lán)蛋白處理組的K562細(xì)胞增殖抑制率較對照組均顯著升高（P<0.01），并呈劑量依賴性的變化；且以藻藍(lán)蛋白孵育4天對K562細(xì)胞增殖的抑制作用最明顯，40、80和160μg/ml組第4天細(xì)胞抑制率分別為24.76％±4.96％、37.95％±5.13％和46.61％±2.64％（附表）。Tabel . Inhibition rate of phycocyanin （PC） with different concentrations on K562 cells analyzed by MTT test （略）
各組K562細(xì)胞的總RNA提取和鑒定
各組總RNA用紫外分光光度儀測定其A260 和A280 比值，結(jié)果顯示比值均在1.8-2.0范圍，證實(shí)了總RNA的完整性。1.5%瓊脂糖凝膠電泳可見5S、18S、28S 3條特征帶，且28S條帶含量約是18S條帶的2倍，上樣孔周圍無明顯EB染色出現(xiàn)，表明無降解和DNA污染，純度附合要求。
藻藍(lán)蛋白對K562細(xì)胞內(nèi)FAK mRNA表達(dá)水平的影響
檢測結(jié)果如 圖2所示，各組PCR產(chǎn)物條帶的FAK/GAPDH光密度比值分別為：0.40（對照組）、0.88（40 μg/ml組）、1.03（80 μg/ml組）、0.91（160 μg/ml組）和1 36（正常人BMMNC）。與正常人BMMNC比較，K562細(xì)胞內(nèi)FAK基因表達(dá)明顯降低；不同濃度藻藍(lán)蛋白處理4天后K562細(xì)胞內(nèi)FAK基因表達(dá)明顯增加，但各濃度組間無劑量依賴性。
討論
藻藍(lán)蛋白是螺旋藻的重要組分之一。研究表明，藻藍(lán)蛋白有較高的生理活性和藥用價值，如防治腫瘤，提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)動物血細(xì)胞再生等［6］。本實(shí)驗再次證實(shí)了藻藍(lán)蛋白抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。我們發(fā)現(xiàn)，藻藍(lán)蛋白對人白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞增殖的抑制作用與細(xì)胞表面的整合蛋白β1的功能相關(guān)。為了闡明其作用機(jī)理，我們做了進(jìn)一步研究。
FCM結(jié)果顯示，在CML急變期病人的BMMNC和K562細(xì)胞表面整合蛋白β1均高表達(dá)，而藻藍(lán)蛋白并不改變其表達(dá)量。業(yè)已證明，整合蛋白β1的高表達(dá)與CML祖細(xì)胞中的P210融合蛋白的刺激有關(guān)，且P210蛋白對其正常信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)有抑制作用。此外，Lundell等［7］通過克隆形成實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，ph+細(xì)胞的整合蛋白介導(dǎo)的生長抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能存在缺陷。因此我們推測，藻藍(lán)蛋白可能通過改善整合蛋白β1的功能缺陷，而非改變其表達(dá)量發(fā)揮作用。為了證實(shí)這一點(diǎn)，我們檢測了藻藍(lán)蛋白處理組K562細(xì)胞內(nèi)FAK的基因表達(dá)水平。
眾所周知，F(xiàn)AK處于整合蛋白信號通路與生長因子信號通路的交匯點(diǎn)，在生長因子受體系統(tǒng)與整合蛋白協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞的活化、增殖、凋亡等活動中發(fā)揮重要作用［8］。它是一種胞內(nèi)非受體型酪氨酸蛋白激酶，參與了細(xì)胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起承上啟下的作用［9］。RT-PCR檢測結(jié)果表明，K562細(xì)胞與正常人BMMNC相比，F(xiàn)AK基因表達(dá)水平明顯降低。藻藍(lán)蛋白處理后K562細(xì)胞內(nèi)FAK基因表達(dá)水平顯著增加。因此我們推測，藻藍(lán)蛋白可能通過抑制P210融合蛋白誘導(dǎo)FAK發(fā)生過度磷酸化，提高胞內(nèi)具有正常功能的FAK表達(dá)量和活性，而恢復(fù)整合蛋白β1信號通路對CML ph+細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控。此結(jié)果與常鉉等［5］的實(shí)驗結(jié)果一致，從而證實(shí)恢復(fù)整合蛋白β1對CML ph+細(xì)胞的增殖抑制功能是治療CML的有效途徑之一。同時本研究也證明，藻藍(lán)蛋白的確有抗腫瘤的功效，是一種很有開發(fā)潛力的藥物。
